半胱氨酰亞砜裂解酶（CSL）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

可見(jiàn)分光光度法

貨號(hào)：BC5390

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：試劑放于試劑瓶?jī)?nèi)EP管中。臨用前加入4 mL蒸餾水溶解，-20℃分裝可保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本量將試劑二用蒸餾水稀釋5000倍，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：20μmol/mL 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。

4、 0.625μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的配制：臨用前取30μL的20μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液于EP管中，加入930μL蒸餾水充分溶解，配制成0.625μmol/mL的丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液備用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

半胱氨酰亞砜裂解酶，簡(jiǎn)稱蒜酶，又名蒜氨酸酶。半胱氨酰亞砜裂解酶幾乎存在于所有蔥屬植物中，如大蒜，洋蔥，韭菜等。蒜氨酸酶存在于液泡內(nèi)，其天然底物蒜氨酸存在于細(xì)胞質(zhì)中；蒜氨酸酶與蒜氨酸接觸并催化產(chǎn)生蒜素和順、反式阿霍烯并生成丙酮酸和氨等副產(chǎn)物，也是大蒜等植物辛辣氣味的主要來(lái)源。

半胱酰胺亞砜裂解酶可以催化S-甲基-L-半胱*酸亞砜生成丙酮酸。丙酮酸可與2,4-二硝*苯肼反應(yīng)生成2,4-二硝*苯腙，在堿性條件下顯棕紅色；測(cè)定505nm吸光度的變化，即可計(jì)算CSL酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿，4℃浸提30分鐘。12000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2. 液體樣本：直接測(cè)定。(若溶液呈現(xiàn)渾濁，則離心取上清后再測(cè)定)。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至505nm，用蒸餾水調(diào)零。

2、操作表（1.5mLEP管內(nèi)操作）：

混勻，室溫放置10min，于1mL玻璃比色皿內(nèi)測(cè)定505nm波長(zhǎng)處的吸光度。記作A_測(cè)定，A_對(duì)照，A_{標(biāo)準(zhǔn)}，A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}。（標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管只需做1-2次。）

三、CSL活性計(jì)算

(1) 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：37℃，每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

CSL活性（U/mg prot）=（?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷（V_樣×Cpr）÷T×F=0.0208×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷Cpr ×F

(2) 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃，每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

CSL活性（U/g 質(zhì)量）=（?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷（V_樣÷V_樣總×W）÷T×F=0.0208×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F

(3) 按血清（漿）等液體體積計(jì)算

單位的定義：每mL血清（漿）等液體每分鐘催化產(chǎn)生1μmol 丙酮酸定義為一個(gè)酶活力單位。

CSL活性（U/mL）=（?A_測(cè)定×C_{標(biāo)準(zhǔn)}÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}）×V_樣÷V_樣÷T×F=0.0208×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}×F

C_{標(biāo)準(zhǔn)}: 丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，0.625μmol/mL；V_樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.1mL；V_樣總：加入的提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定結(jié)果?A_測(cè)定＞1，可以對(duì)樣本用蒸餾水進(jìn)行稀釋或者縮短第一步反應(yīng)時(shí)間；吸光值較小，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)第一步反應(yīng)時(shí)間至1h或者更長(zhǎng)時(shí)間。注意計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

2. 對(duì)于初次測(cè)定樣本，建議將樣本勻漿液用蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋后測(cè)定，選取最佳的稀釋倍數(shù)。洋蔥、香菇、大蒜類樣本建議直接稀釋4-10倍后再進(jìn)行最佳稀釋倍數(shù)摸索。（實(shí)驗(yàn)室洋蔥進(jìn)行了8倍稀釋，蒜進(jìn)行了64倍稀釋）

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1233g蒜樣本，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，對(duì)上清用蒸餾水稀釋64倍，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.689-0.184=0.505，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.738-0.026=0.712，帶入公式計(jì)算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F=7.658 U/g 質(zhì)量。

2、 稱取0.1263g洋蔥樣本，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，對(duì)上清稀釋4倍，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得計(jì)算?A_測(cè)定=A_測(cè)定-A_對(duì)照=0.66-0.411=0.249，?A_{標(biāo)準(zhǔn)}=A_{標(biāo)準(zhǔn)}-A_{標(biāo)準(zhǔn)空白}=0.738-0.026=0.712，帶入公式計(jì)算：

CSL活性（U/g 質(zhì)量）= 0.0208×?A_測(cè)定÷?A_{標(biāo)準(zhǔn)}÷W×F=0.230 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Su Qianqian, Tang Jing, Zhao Liyan, et al. Effects of nanocomposite packaging on the quality and formaldehyde content of shiitake mushrooms during storage [J]. Food Science, 2015(8):6.

[2] Kumagai H, ?Hidetoshi KONO, Sakurai H, et al. Comparison of C-S Lyase in Lentinus edodes and Allium sativum [J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2022(66): 2560–2566. 

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