血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5545

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

產(chǎn)品說明：

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE，EC 3.4.15.1，也稱為ACE1）是一種含鋅二肽羧基肽酶，相對(duì)分子質(zhì)量為120-150kDa，主要存在于肺、腦、腎等各種組織內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞、血漿和尿液中也有存在，正常情況下肺組織含量最高。ACE主要功能是催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，后者可引發(fā)血管強(qiáng)烈收縮，促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素醛固酮的合成和釋放。ACE活性檢測(cè)對(duì)于肺部、肝臟、甲狀腺等器官疾病的診斷和治療具有重要意義。

ACE可催化底物N-[3-（2-呋喃基）丙烯?；?/span>]- L -苯丙氨酰-甘氨酰-甘*酸（FAPGG）水解生成呋喃丙烯?；?/span>- L -苯丙*（FAP）和雙甘氨肽（GG）。FAPGG在340nm處有特征吸收峰，根據(jù)其在340nm的變化速率，可計(jì)算得到ACE活性大小。

FAPGG（340nm）                               FAP + GG

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、分析天平、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間5min）。12000g，4℃離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血漿/血清：直接測(cè)定。若有渾濁請(qǐng)離心后取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一于37℃預(yù)熱10min以上。

3、 在微量石英比色皿/96孔UV板中按下表步驟加樣：

三、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性計(jì)算

1. 使用微量石英比色皿測(cè)定：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：37℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol FAPGG水解定義為一個(gè)酶活力單位。

ACE活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（Cpr×V樣本）÷T×F=527.7×ΔA÷Cpr×F

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：37℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol FAPGG水解定義為一個(gè)酶活力單位。

ACE活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（W×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F=527.7×ΔA÷W×F

（3） 按細(xì)胞計(jì)算

單位的定義：37℃下每10⁴個(gè)細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol FAPGG水解定義為一個(gè)酶活力單位。

ACE活性（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷（N×V樣本÷V提?。?/span>÷T×F=527.7×ΔA÷N×F

（4）按照血清（漿）體積計(jì)算

單位的定義：37℃下每mL血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘催化1nmol FAPGG水解定義為一個(gè)酶活力單位。

ACE活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣本÷T×F=527.7×ΔA×F

ε：FAPGG在340nm處的摩爾消光系數(shù)，758L/(mol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L； 10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.1mL；V提取：加入試劑一的體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞總數(shù)，以10⁴計(jì)；F：稀釋倍數(shù)。

2. 使用96孔UV板測(cè)定：

將上述公式中的d=1cm改為d=0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，請(qǐng)嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和操作時(shí)間。

2. 樣本吸光度初始值A1測(cè)定大于1.6（微量石英比色皿）/1（96孔UV板）或ΔA測(cè)定大于0.4（微量石英比色皿）/0.3（96孔UV板）時(shí)，建議將樣本用試劑一稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA測(cè)定小于0.01時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來測(cè)定。計(jì)算時(shí)注意同步更改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1027g小鼠肺臟樣本，加入1mL試劑一進(jìn)行冰浴勻漿，離心后取上清，稀釋4倍后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA空白=A1空白-A2空白=1.0037-1.0021=0.0016，ΔA測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定= 1.4637-1.1426=0.3211，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.3211-0.0016=0.3195，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ACE活性（U/g 質(zhì)量）=527.7×ΔA÷W×F =6566.705 U/g 質(zhì)量。

2. 取牛血清樣本，稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算：ΔA空白=A1空白-A2空白=1.0037- 1.0021=0.0016，ΔA測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.2163-1.1277=0.0886，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.0886-0.0016=0.087，按血清（漿）體積計(jì)算酶活得：

ACE活性（U/mL）= 527.7×ΔA×F=91.820 U/mL。

參考文獻(xiàn)：

[1] Murray B A, Walsh D J, Fitzgerald R J. Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanylglycylglycine assay for determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activity[J]. Journal of Biochemical & Biophysical Methods, 2004, 59(2): 127-137.

[2] Gajanan P G, Elavarasan K, Shamasundar B A. Bioactive and functional properties of protein hydrolysates from fish frame processing waste using plant proteases[J]. Environmental Science & Pollution Research, 2016, 23(24): 24901-24911.

[3] Sun S, Xu X, Sun X, et al. Preparation and Identification of ACE Inhibitory Peptides from the Marine Macroalga Ulva intestinalis[J]. Marine Drugs, 2019, 17(3).

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