志賀氏菌熒光定量PCR檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟

更新時(shí)間：2012-12-13

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志賀氏菌屬產(chǎn)品介紹

本試劑盒采用TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，用于志賀氏菌的PCR體外特異性檢測。檢測靈敏度為100拷貝/mL。定量檢測線性范圍為：10-1010拷貝/mL。

志賀氏菌屬試劑盒組成

規(guī)格	48次檢測
DNA提取液	3mL/管
志賀氏菌PCR反應(yīng)液	1100µL/管
Taq酶（5U/µL）	24µL /管
志賀氏菌陽性對(duì)照	100µL/管
志賀氏菌陰性對(duì)照	100µL/管
說明書	1份

實(shí)驗(yàn)操作步驟：

1. DNA提取：取增菌液1mL加到1.5mL無菌離心管中，10,000rpm離心5min，棄去上清；加入50µL DNA提取液，充分混勻后沸水浴5 min，13,000rpm離心5min，取上清液進(jìn)行檢測或保存于-20℃以待檢測。

2. 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（在試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)完成）

2.1. 從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液，冰盒上融化后混勻。試劑在使用前2000rpm離心20s備用。

2.2. 設(shè)需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N = 待檢樣本數(shù)+ 1管陰性對(duì)照 +1管陽性對(duì)照）。

2.3. 混合液的配制：先吸取體積為22.6（µL）×N反應(yīng)液1.5mL滅菌離心管，再加入Taq DNA聚合酶0.4 （µL）×N，混勻后2000rpm離心20s，然后向N 個(gè)0.2mL PCR反應(yīng)管中分裝已加入Taq酶的混合液23µL/每管，蓋緊管蓋。

2.4. 注意：陰性對(duì)照管建議在此區(qū)中加入2µL陰性對(duì)照樣品。

3. 加樣（在樣品制備區(qū)完成）

3.1. 陽性對(duì)照取出解凍，使用前2000rpm 離心20s。

3.2. 將保存在-20℃的核酸提取物置室溫解凍，以13,000rpm離心5min；向N個(gè)PCR管中分別加入待檢樣本DNA（包括陽性對(duì)照）2µL，蓋緊管蓋，2000rpm離心20s，將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移核酸擴(kuò)增區(qū)。注意做好樣品號(hào)標(biāo)記。

4. PCR擴(kuò)增（在核酸擴(kuò)增區(qū)完成）

4.1. 上機(jī)前應(yīng)檢查各反應(yīng)管是否蓋緊。

4.2. 反應(yīng)體系設(shè)為25µL；熒光信號(hào)采集設(shè)定在退火溫度。對(duì)于多通道熒光PCR儀，選擇熒光素FAM為信號(hào)采集通道。

4.3. PCR循環(huán)參數(shù)為：*階段，95℃ 3 min預(yù)變性；

第二階段，[95℃ 10s；60℃ 40s] × 40次循環(huán)。

注意：在的LightCycler上使用，變性溫度95℃改為93℃，其他不變。

5. 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果判斷

5.1 綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)及擴(kuò)增曲線，設(shè)定合理的閾值（Threshold）和基線（Baseline），使儀器給出正確的結(jié)果。

5.2 陰性對(duì)照CT值應(yīng)顯示為0或≥40.0，陽性對(duì)照的CT值應(yīng)≤30.0，否則視實(shí)驗(yàn)失敗，需重做。

5.3 檢測樣品CT≤35.0，結(jié)果有效，可直接報(bào)告樣品陽性。

5.4 檢測樣品35.0<CT>40.0，需進(jìn)行一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若CT仍介于35.0和40.0之間，且曲線有明顯的指數(shù)增長特性，同時(shí)陰性對(duì)照Ct值為零，可報(bào)告樣品陽性，否則報(bào)告樣品陰性。

5.5 檢測樣品CT值為零，報(bào)告樣本陰性。

注意事項(xiàng)

1. 本試劑盒僅用于體外檢測使用，操作人員必須經(jīng)過培訓(xùn)并具有一定的經(jīng)驗(yàn)，試劑盒使用前請仔細(xì)閱讀說明書全文。

2. 請嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

3. PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格分區(qū)操作；各區(qū)應(yīng)有的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人員應(yīng)遵循從一區(qū)到二區(qū)的單方向工作原則，各工作區(qū)相對(duì)隔離；進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的工作桌面和及相關(guān)物品應(yīng)定期用1%次氯酸鈉、75%酒精、1mol/L鹽酸或紫外燈進(jìn)行滅菌和消毒。

4. 試劑盒中各試劑充分融化后請短暫離心。反應(yīng)液分裝時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免污染儀器。

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