1. 大多數(shù)限制酶貯存在50%甘油溶液中,以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當終反應液中甘油濃度大于12%時,某些限制酶的識別特異性降低,從而產(chǎn)生星活性,更高濃度的甘油會抑制酶活性。因此加入反應的酶體積不超過反應總體積的1/10,避免限制酶活性受到甘油的影響。

2. 濃縮的限制酶可在使用前用1×限制酶緩沖液稀釋,但切勿用水稀釋以免酶失活,用水稀釋的酶不能長期保存。

3. 反應體系中Mg2+是限制酶僅有的共同因子,當用其它二價陽離子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA時,酶活性會被抑制,或改變酶的特異性,導致星型反應。

4. 多種因素可引發(fā)星型反應：①非適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機溶劑的存在。

5. 反應混合物中DNA底物的濃度不宜太大,小體積中過高濃度的DNA會形成粘性DNA溶液抑制酶的擴散,并降低酶活性。建議酶切反應的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。

6. 酶切反應所加入的酶量應適中,根據(jù)底物的種類、量的多少和體積的大小而定,對不同的限制酶,各廠家均有一大的消化量指標可參考。

7. 當要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時,如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好,則兩種酶可同時切割,如果這些酶所要求的緩沖液有所不同,則可采用以下兩種替代方法：①先用在低離子強度的緩沖液中活性高的酶切割DNA,然后加入適量NaCl及第二種酶,繼續(xù)反應；②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。

8. 用同一種酶切割不同的DNA時,所需酶量不同,可根據(jù)DNA底物上酶切位點的多少與λDNA存在位點的數(shù)目比較后,決定用酶量。對于超螺旋DNA,基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA,使用的酶單位活性應適當加大。

9. 反應混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA,可維持酶的穩(wěn)定性。

10.酶切底物DNA應具備一定的純度,其溶液中不能含有跡量酚、氯仿、,大于10mM的EDTA,去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度,否則會不同程度地影響限制酶的活性。

11.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個重要因素,所以轉(zhuǎn)化實驗所選擇的受體菌株應考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。

12.要保證酶作用時的佳反應條件（ph, 溫度）和底物用量,酶反應才能有效地進行。

13.反應取酶時應使用無菌吸頭,以免污染酶液,同時應盡量縮短酶在溫室的放置時間。

14.高于37℃或需長時間保溫時,可加入礦物油覆蓋在反應液上以減少水分蒸發(fā)。

15.反應混合物混勻時,應避免強烈振蕩以保證不使內(nèi)切酶變性及DNA大分子的完整。

16.反應前的低速離心是必要的,這可使因混勻吸附于管壁上的液滴全部沉管底。

17.用已硅化的離心管進行酶切反應,可獲得更佳的酶切效果,否則DNA可能粘附于管壁而影響酶切效果。

18.終止酶反應可根據(jù)需要采用不同的方法：①酶切后不需進行下一步反應,可加入含EDTA的終止液終止反應；②若需進一步反應（如連接,切割等）,可將反應管置65℃保溫20-30分鐘,以滅活酶終止反應。③可用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀獲得較純DNA進行下一步酶學操作。

19. 不同廠家的試劑不可混用,需要時請查明相關(guān)條件及數(shù)據(jù)。